大花紅景天中紅景天苷與酪醇的分離制備

【核心介紹】目的：建立一種快速高效的制備分離紅景天中紅景天苷與酪醇的方法。方法：采用高速逆流色譜法對紅景天乙醇提取物中的紅景天苷和酪醇進行富集，溶劑體系為正丁醇：乙酸乙酯：水（2:3:5），儀器轉速900 r/min，流速2 mL/min，檢測波長254 nm。對富集后的樣品進行半制備液相色譜二次純化，流動相為甲醇-水，流速4 mL/min，檢測波長275 nm。通過紫外-可見光譜、紅外光譜、質譜、核磁共振波譜對紅景天苷和酪醇進行了結構確證。結論：該方法操作簡單、制備量大、純度高，可為新藥研究和工業化生產提供參考。 　

大花紅景天中紅景天苷與酪醇的分離制備

賀天雨^1,2，王尉^1,2，徐雙雙^1,2，趙新穎^1,2，張經華^1,2

（1 北京市理化分析測試中心，北京 100089;2 有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京 100094）

摘 要： 目的：建立一種快速高效的制備分離紅景天中紅景天苷與酪醇的方法。方法：采用高速逆流色譜法對紅景天乙醇提取物中的紅景天苷和酪醇進行富集，溶劑體系為正丁醇：乙酸乙酯：水（2:3:5），儀器轉速900 r/min，流速2 mL/min，檢測波長254 nm。對富集后的樣品進行半制備液相色譜二次純化，流動相為甲醇-水，流速4 mL/min，檢測波長275 nm。通過紫外-可見光譜、紅外光譜、質譜、核磁共振波譜對紅景天苷和酪醇進行了結構確證。結論：該方法操作簡單、制備量大、純度高，可為新藥研究和工業化生產提供參考。

關鍵詞：分離制備；紅景天苷；酪醇；高效液相色譜法；高速逆流色譜法

中圖分類號：R284

Separation and Preparation of Salidroside and Tyrosolfrom Rhodiolacrenulata

He Tianyu^1,2, Wang  Wei^1,2, Xu  Shuangshuang^1,2,Zhao  Xinying^1,2,

Zhang  Jinghua^1,2

(1 Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China

2BeijingKey Laboralory of Detection Technology & Quality evaluation of Organic Material,Beijing100094,China)

Abstract: Objective：A rapid and efficient method for preparation of Salidroside and Tyrosol from Rhodiola crenulata was established. Methods：Salidroside and tyrosol in the Rhodiola crenulata ethanol extract were enriched by using HSCCC with N-butanol: ethyl acetate: water (2: 3: 5)as the solvent system, The flow rate was 2mL/min while the apparatus rotated at 900 r/min and the detection wavelength was at 254 nm. The concentrate was purified by semi-preparative liquid chromatography furtherly. The mobile phase consisted of methanol-water, the flow rate was 4 mL/min, and the detection wavelength was 275nm. The structures of salidroside and tyrosol were confirmed by UV-Vis, IR, MS and NMR spectroscopy. Conclusion：The method that has the advantages of simple operation, large preparation volume and high purity can provide reference for new drug research and industrial production.

Key words: separation preparation; salidroside; tyrosol; high performance liquid chromatography; high-speed counter-current chromatography

我國的紅景天屬資源十分豐富，共有70多種，大約是世界紅景天資源的 80%^[1]。紅景天種類植物的根莖甚至是全株既有藥用價值，也可作為保健食品的原材料，且紅景天種類植物具有低溫干燥、晝夜溫差大與缺氧等嚴苛的生長條件，使其擁有了極強的生命力與適應能力。隨著現代社會人們的生活水平不斷提高，對天然的、無毒副作用的食品、藥品或保健品的需求量不斷上升^[2]。

本文所使用的原材料是大花紅景天，主要化學成分有苷類^[3-4]、黃酮類^［5］、有機酸類^［6］、揮發油類^[7]、糖苷類^{［6、8］}等。紅景天苷及其代謝產物酪醇是紅景天屬植物中廣泛存在的兩種化合物，具有抗疲勞^[9]、抗衰老^[10]、抗缺氧^[11]、抗輻射^[12]以及抗癌^[13-14]等多種藥理作用，可以預防和治療多種疾病^[15]。

本文首次嘗試采用高速逆流色譜與半制備液相色譜相結合的方法分離制備紅景天苷與酪醇，產品純度達到99%以上。并通過紫外-可見光譜、紅外光譜、質譜、核磁共振波譜對以上兩種化合物進行了結構確證。該制備方法具有上樣量大，回收率高的特點，為新藥的研究開發與紅景天藥材的應用提供了參考依據。

1材料與方法

1.1 儀器與材料

KQ-250E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TBE-300B半制備型高速逆流色譜儀（上海同田生物技術有限公司）；LC-20高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；1525EF半制備型液相色譜（美國Waters公司）；RE-2000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；ALPHR1-2冷凍干燥機（德國Marin Christ公司）。

乙酸乙酯，甲醇，正丁醇（北京化工廠）；乙醇（色譜純，Thermo Fisher公司）。

2 實驗部分

2.1紅景天的提取

以大花紅景天為原料提取紅景天粗提物。用電子天平稱取500 g大花紅景天，粉碎過60目篩。乙醇為提取溶劑，料液比1:10，提取1h，過濾，重復提取2次，合并濾液，使用旋轉蒸發儀進行濃縮后，冷凍干燥，備用。

2.2紅景天HPLC分析方法

色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C₁₈（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動相：A為甲醇，B為水，0-20 min，20%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；運行時間２0 min；檢測波長為275 nm；進樣量5μL。

2.3紅景天苷與酪醇的分離制備

2.3.1高速逆流色譜法富集

HSCCC溶劑體系為正丁醇：乙酸乙酯：水=2:3:5，將配制好的溶劑靜置過夜，取上相為固定相，下相為流動相，分別超聲脫氣30 min。

HSCCC操作過程如下：稱取紅景天粗提取物250 mg，等體積上下相溶解后，備用。泵入固定相（上相），流速10 mL/min，泵入固定相400 mL；換流動相（下相），主機正轉，緩慢調節轉速至900 r/min；泵入流動相，流速2 mL/min；25℃分離溫度，波長254nm下檢測。待流動相從出口流出時，上樣。根據HSCCC圖收集目標化合物，旋轉蒸發去除溶劑，冷凍干燥后備用。

2.3.2半制備型液相色譜分離純化

色譜條件：半制備型色譜柱xBridge Prep-C18（10 mm×150 mm, 5 μm）；紅景天苷樣品半制備液相色譜流動相為甲醇/水=20:80，運行時間30 min，檢測波長為275 nm；酪醇樣品半制備液相色譜流動相為甲醇/水=25:75，運行時間30 min；檢測波長為275 nm。

收集目標餾分，旋轉蒸發去除溶劑，冷凍干燥后最終得到紅景天苷樣品及酪醇樣品。

2.4 結構確證

本文采用紫外-可見光譜（UV-Vis）、紅外光譜（IR）、質譜（MS）、核磁共振（NMR）進行結構確證。

2.4.1 紫外-可見光譜分析條件

使用甲醇為溶劑配制紅景天苷、酪醇0.1 mg/mL，掃描范圍200-600 nm。

2.4.2紅外光譜分析條件

KBr壓片法；掃描范圍4000-400 cm-1；分辨率4 cm-1；掃描次數64次。

2.4.3高分辨質譜分析條件

HPLC分析條件：色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×3.0 mm, 3.5 μm）；流動相：A為甲醇，B為水，0-20 min，其中紅景天苷為15%A，酪醇為30%A；流速：0.4 mL/min；柱溫：30℃；運行時間：20 min。

MS條件：正、負兩種離子模式，Sheath gas 40 L/min；Aux gas：15 L/min；Spray voltage：3.0 kV；Capillary temp：320℃；Aux Gas heater temp：350℃；Scan：150 to 2200 m/z。

2.4.4核磁共振分析條件

氘代試劑CD3OD，TMS內標，檢測1H-NMR和13C-NMR。

3 結果與討論

3.1紅景天樣品分析

采用HPLC法對紅景天粗提取物和紅景天苷對照品、酪醇對照品進行分析，見圖1。確定保留時間7.3min的化合物為紅景天苷、保留時間8.4 min的化合物為酪醇。

圖1 紅景天HPLC色譜圖

a.紅景天粗提物；b.紅景天苷對照品；c.酪醇對照品

3.2紅景天苷與酪醇的分離制備

圖2 紅景天提取物HSCCC色譜圖

對HSCCC獲得的紅景天苷與酪醇樣品進行二次分離純化，按2.2.2條件進樣，收集23-28 min餾分Ⅲ,為紅景天苷。收集42-45 min餾分Ⅳ，為酪醇。見圖3。

a.紅景天苷樣品半制備液相色譜圖；b.酪醇樣品半制備液相色譜圖；

圖3半制備液相色譜圖

對純化后的紅景天苷樣品與酪醇樣品進行純度分析，見圖4，經扣除溶劑色譜峰后，對樣品色譜峰進行面積歸一法，測定紅景天苷純度為99.6%；測定酪醇純度為99.9%。

圖4HPLC色譜圖

a.純化后的紅景天苷；b.純化后的酪醇

3.3 紅景天苷和酪醇的結構確證

3.3.1紫外-可見光譜分析

通過對制備得到的紅景天苷和酪醇進行紫外-可見光譜掃描，分別見圖5，在279 nm和278 nm處有最大紫外吸收，符合紅景天苷和酪醇的紫外吸收的特征。

圖5 紫外-可見光譜圖

a.紅景天苷；b.酪醇

3.3.2 紅外光譜分析

通過對制備得到的樣品進行紅外光譜掃描，見圖6。紅景天苷官能團歸屬如下：3281 cm-1：OH的對稱伸縮振動；2952 cm-1：CH2的對稱伸縮振動；1615 cm-1：苯環的伸縮振動；1517 cm-1：苯環的伸縮振動；1444 cm-1：CH2的變形振動；1242 cm-1：CH2的卷曲振動；1073 cm-1：C-O-C不對稱伸縮振動吸收；1012 cm-1：C-O-C對稱伸縮振動吸收；823 cm-1：苯環鄰二位質子。

酪醇官能團歸屬如下：3386 cm-1：OH的伸縮振動；3134, 3023 cm-1：芳烴的伸縮振動；2927 cm-1：CH2的伸縮振動；2879 cm-1：CH2的伸縮振動；1598，1512 cm-1：芳烴的C=C伸縮振動；1451 cm-1：CH2的卷曲振動；1345 cm-1：βOH；1232 cm-1：C-C伸縮振動吸收；1053 cm-1：C-O伸縮振動吸收；817 cm-1：苯環上2個鄰位H。

圖6 紅外光譜圖

a.紅景天苷；b.酪醇

3.3.3高分辨質譜分析

通過對制備得到的紅景天苷進行高分辨質譜正、負離子模式掃描，見圖7?？傻肹M+Na]+=323.1099與計算的精確分子量323.1107基本一致，[M-H]-=299.1129與計算的精確分子量299.1131基本一致，[2M-H]-=599.2330與計算的精確分子量599.2340基本一致。以上數據與紅景天苷分子量和化學式一致。

通過對制備得到的酪醇進行高分辨質譜正、負離子模式掃描，見圖8，可得[M-H]-=137.0593與計算的精確分子量137.1643基本一致。酪醇正離子模式下未產生離子碎片。

圖7紅景天苷質譜圖

ａ.正離子模式下；b.負離子模式下

圖8酪醇負離子模式下質譜圖

3.3.4 ¹H-NMR和¹³C-NMR

圖9  核磁共振圖譜

a.紅景天苷1H-NMR；b.紅景天苷13C-NMR；c.酪醇1H-NMR ；d.酪醇13C-NMR

表1 紅景天苷和酪醇¹H-NMR和¹³C-NMR數據（氘代溶劑CD₃OD）

對制備獲得的高純度紅景天苷樣品與酪醇樣品進行定性分析，通過對數據的分析和歸屬確認了所制備的樣品為紅景天苷與酪醇。

4 結論

隨著現代社會人們的生活水平不斷提高，紅景天的提取物被廣泛添加到各類商品中。為了滿足中草藥及藥品分析檢測及質量監控工作的需求，本文采用超聲輔助法對紅景天苷和酪醇分別進行粗提取，高速逆流色譜技術進行初步純化，半制備型液相色譜對提取物進一步分離純化，制備出高純度紅景天苷樣品和酪醇樣品。該制備工藝具有分離效果好、產物純度高、分離產量大的特點，為紅景天資源的進一步開發應用提供了參考依據。

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